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實驗推薦——分子標記技術AFLP
點擊次數:2629 更新時間:2023-07-03

實驗推薦——分子標記技術AFLP

實驗方法原理:

AFLP RFLPPCR兩種技術的優點相結合的產物,它既克服了 RFLP 技術復雜、有放射性危害 和 RAPD 穩定性差,標記呈現隱性遺傳的缺點;同時具有分辨率高、穩定性好、效率高的優點。但它的技術費用昂貴,對 DNA 的純度和內切酶的質量要求很高。


其基本原理是先利用限制性內切酶水解基因組 DNA 產生不同大小的 DNA 片段,再使雙鏈人工接頭的酶切片段相連接,作為擴增反應的模板 DNA,然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增,最后在接頭互補鏈的基礎上添加 1—3個選擇性核苷酸作引物對模板 DNA 基因再進行選擇性擴增,,然后把擴增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進行電泳,多態性即以擴增片段的長度不同被檢測出來。


AFLP 技術主要特點 :分析所需DNA 量少,僅需 0.5g;可重復性好;多態性強;分辨率高;不需要 Southern 雜交;樣品適用性廣;


AFLP 技術被認為是一種十分理想、有效的分子標記。

 

實驗材料:

1.1           樣品保存與運輸

樣品類型

樣品要求

植物材料

新鮮組織、葉片采用硅膠干燥后或干冰運輸到實驗室

動物材料

新鮮組織,無水乙醇封存低溫運輸到實驗室

DNA

干冰運輸到實驗室

 

 

 

 

 

實驗步驟:

1.2           DNA 提取(實驗方法視DNA來源而異,此處以普通植物樣本為例)

CTAB法提取

1) 稱取材料50mg,液氮研磨三至四次

2) 將粉末放到裝有800µl 2×CTAB提取緩沖液的2ml離心管中

3) 加入60µl巰基乙醇混勻,60度預熱30min

4) 其間混勻二至三次取出樣品于室溫放置

5) 待樣品冷卻到室溫加入800µl氯仿:異戊醇(241

6) 振蕩混勻,12000rpm離心15min

7) 取上清到一新2ml離心管,加入等體積的氯仿:異戊醇(241),振蕩混勻,12000rpm離心15min

8) 取上清到一新2ml離心管中加入1.5倍體積1×CTAB沉淀液,放置20-30min,12000rpm離心15min

9) 將沉淀晾干溶于200µl TE-buffer(溶解)

10)      加入400 µl 95% 乙醇,20µl  3M NaAC, -20 ℃ 沉淀1小時

11)      4℃ 離心,12000rpm離心15min

12)      500µl 75%乙醇洗滌,12000rpm離心10min

13)      加入30-50µl TE-buffer

14)      0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測

備注CTAB法主要針對植物基因組DNA的提取,其它樣品:如動物組織、細胞、菌體等公司有相關試劑盒。

 

1.3           限制性酶切及連接反應

反應體系


組分

對照(體積)

樣品(體積)

DNA模板(50ng/μl

4μl

4μl

Adapter

1μl

1μl

EcoR I/MseI 

2μl

2μl

10XReaction buffer

2.5μl

2.5μl

10mM ATP

2.5μl

2.5μl

T4 Ligase

1μl

1μl

H2O

7μl

7μl

混勻離心數秒 37℃保溫5h ,8℃保溫4h,4℃過夜。

-20℃保存,作為預擴增模板

 

1.4  預擴增

反應體系

組分

體積

DNA

2μl

Pre-ampmix(預擴引物)

1μl

dNTPs

1μl

10XPCR buffer

2.5μl

Taq

0.5μl

ddH2O

18μl


離心數秒,按下列參數進行PCR擴增

94  2min

       94  30S

       56  30S,      30 cycles

      72  80S

    72  5min

    4

 

 

1.5 選擇性擴增

預擴產物1:20稀釋后作為選擴模板

按以下體系混勻后,離心數秒

 

組分

體積

預擴稀釋樣品

2μl

10XPCR buffer

2.5μl

dNTP  

0.5μl

EcoRI 引物

1μl(共8種)

MseI 引物

1μl(共8種)

Taq

0.5μl

ddH2O

17.5μl 

Total volum

25μl

 

按下列參數設置PCR循環

1)   第一輪擴增參數:94  30S  65  30S,  72  80S

2)   以后每輪循環溫度遞減0.7℃,擴增12輪。

3)   接著按下列參數擴增23

94  30S,

55  30S         23 Cycles

72  80S

4)  72   5min

 5 4



 


 

1.6實驗結果

ABI377測序儀電泳檢測。數據通過GENESCAN軟件進分析。

電泳圖譜


峰圖


原始數據


01數據

遺傳聚類圖


實驗說明:

 

1.7 數據分析說明

1) ROX500分子量內標

      ROX500ROX紅色熒光標記的分子量內標,從小到大,片段大小依次為:7080、90100、120、140、160180、190、200、220、240、260、280、300320、340、360、380、400425、450、475490、500bp),共25條帶。

2) 原始數據

  公司為客戶提供ABI377測序儀電泳檢測后的片段大小,即原始數據。數據是通過GENESCAN軟件進分析,軟件每2個堿基讀一次數,Marker片段范圍為 70-500bp,這樣在70-500 bp之間一共讀取216個數,由于不可避免的誤差,在所設置的片段Bin Range范圍內的片段,認為是同一條帶,例如:在71.5-73.5 之間,c1 、c2擴增條帶大小分別為73.00835 71.9044,這樣的誤差范圍在我們的誤差允許范圍認為是同一條帶。

201數據

      在原始數據的基礎上,有帶的地方替換為1,無帶的地方替換為0,這樣構成了01數據,同時給客戶發一份所有01數據匯總后的總數據。

由于軟件要求,我們一般都會給客戶把數據處理成NTSYSpc2.1 這個軟件要求的標準的01數據格式即01總數據。01總數據中 r1-r216 表示第一個引物,r217-r432 代表第二個引物和01分數據一一對應。

如: 一共有8個引物:a-1a-2、a-3、b-1、b-2c-1、d-1…….等,在總數據中按順序排列:

   R1-  r216 的數據為:a-1 這個引物的數據

   R217-r432 的數據位:a-2 這個引物的數據……..,以此類推。

 

常見問題:

 1)客戶委托公司做實驗服務,客戶需要做哪些工作?

    客戶只需提供實驗材料,我們負責DNA提取及后續全部試驗。收到樣品后,我們一般會給客戶做預實驗,根據客戶預實驗結果,客戶滿意度,決定是否安排后續實驗。公司現有64個引物組合,全部為FAM熒光標記,我們會從中篩選條帶清晰、多態性較好的引物組合給客戶。在開始正式實驗前,客戶需支付課題服務一半的費用,余款在公司給客戶發送最后一批數據前,一次結清。

2) 關于AFLP收費價格

目前我們的基本價格是30個樣,6~8對引物,6000元,實驗周期大約為20天,如果您樣品較多或引物組合較多,具體可協商。

3)條帶數太多

PCR產物在ABI測序儀上電泳,檢測系統的靈敏度要比銀染高的多,數據分析是通過GENESCAN軟件進行分析,所以對于很弱的帶,如果人工統計的話,不會把這樣的帶統計進去,但軟件分析的話,會讀到這樣的帶。所以通過測序儀檢測比銀染條帶數多,這個可以理解。另外我們一般通過控制熒光信號強度來控制條帶數,對于擴增強以及擴增相對較弱的引物,通過控制熒光信號強度,盡量保證條帶數在50~60條,最大限度減少由于擴增強度的問題,引起的條帶數的差異,最真實的反映實驗結果。

4)能否找到所有差異帶的具體位置,并回收克隆差異條帶?

請參照提供數據結果中,原始數據部分,數據表中,每個檢測位點都有片段大小,有帶的地方是片段的實際大小,無帶的為0,很容易找到差異帶。目前我們采取的熒光引物,跑測序膠,只能指出差異帶的具體位置及片段大小,不能夠回收克隆差異帶。

5)共有譜帶較少,多態性太高

   共有譜帶為所有樣品在某一位點擴增后共有的條帶。因此只要有一個樣品的擴增不好,或者在這個樣品無擴增,就會導致共有普帶數較少或沒有。所以一定要保證實驗材料新鮮,這樣我們才能夠保證后續試驗中的PCR擴增沒問題。如果樣品確實有問題,為了不影響整體數據要去除這類樣品。

 

鼎國產品推薦

DNA提取純化試劑盒

貨號

名稱

品牌

規格

市場價(元)


DNA提取




GV-CT-DNA-50/100

植物基因組DNA提取試劑盒(CTAB)

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50T/100T

200/380

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Genview

50T/100T

300/550

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Genview

50T/100T

300/550

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Genview

50T/100T

380/660

NEP001

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50T/100T

300/550

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50T/100T

400/750

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鼎國

50T/100T

360/660

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鼎國

50T/100T

280/500

NEP062

動物組織/細胞/血液基因組DNA提取試劑盒

鼎國

50T/100T

350/600


DNA純化回收




GV-PCR-P-50/100

高效DNA片段回收試劑盒

Genview

50T/100T

180/350

GV-GX-50/100

高效DNA凝膠回收試劑盒

Genview

50T/100T

180/350

NEP013

離心柱型溶液/凝膠DNA回收試劑盒

鼎國

50T/100T

150/240

PCR擴增相關試劑

貨號

名稱

品牌

規格

市場價(元)

PER001-2

Taq   DNA Polymerase(10× Taq Buffer含有Mg2+)

鼎國

1000U(2U/μl)

180

PER007-1

2×Taq   PCR Green Mix

鼎國

1ml

120

PER013-2

通用型PCR試劑盒

鼎國

50T

200

GD1102-1ML

dNTPs   10 mM

Genview

1ml

90

PER019

10×PCR   buffer(含Mg2+

鼎國

1ml×10

80

PER018-2

雙蒸水ddH2O

鼎國

500ml

100

電泳相關試劑

貨號

名稱

品牌

規格

市場價(元)

GA05-100G

Agarose 瓊脂糖

Genview

100g

350

NEP031

5×TBE(粉劑)

鼎國

1L

100

GT1308

5×TBE(液體)

Genview

500ml

60

LU362-1KG

Urea    尿素

Genview

1kg

110

GD1305-250UL

DL2000 DNA Marker

Genview

50T

100

分子標記類實驗相關試劑

貨號

名稱

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規格

市場價(元)

MMR001

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鼎國

50T

3500

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鼎國

50T

2500

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50T

3500

MMR002-4

AFLP試劑盒(PstI/MseI型)核心試劑

鼎國

50T

2500

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鼎國

50T

3500

MMR003-4

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50T

2500

MMR001-FISH

熒光標記AFLP試劑盒(EcoRI/MseI型)

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50T

4500

MMR002-FISH

熒光標記AFLP試劑盒(PstI/MseI型)

鼎國

50T

4500

MMR003-FISH

熒光標記AFLP試劑盒(Hind/MseI型)

鼎國

50T

4500

實驗相關儀器

貨號

名稱

品牌

規格

市場價(元)

BD-BGC1

藍光切膠儀

博弗瑞德

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藍光實時觀測儀

博弗瑞德

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DL-600C

雙穩電泳儀

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3360

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瓊脂糖水平電泳槽

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