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一. Folin——酚試劑甲
溶液1):1:2g無水碳酸鈉溶于100m10.2mol/l氫氧化鈉中(以配制成 5X),用時稀釋5倍。
溶液2):0.5g 五水硫酸銅溶于100ml1%酒石酸鉀鈉(或酒石酸鈉)溶液。將稀釋后
的溶液 1 與溶液 2 ,以50:1的比例混合?;旌虾蠹礊?span style="font-family:arial">Folin——酚試劑甲,此試劑只
能用一天,過期失效。
二.Folin——酚試劑乙
原溶液度為2moL/L使用前需稀釋一倍,用多少稀釋多少,使其zui后濃度為 1moL/L,
此為Folin——酚試劑乙應用液。Folin——酚試劑乙原液平時應封閉貯存于 4°C冰箱
中避光
保存。
三.操作方法
標準曲線的制作:取14支試管分成兩組,按下表順序加入試劑,混勻,于室溫
放置10分鐘。再加入0.5毫升試劑乙,立即搖勻,在室溫放置 30 分鐘,然后于
500nm 處比色。測定光密度值。取兩種測定的平均值,以蛋白質濃度為橫座標,
光密度值為
縱座標,繪制標準曲線為
定量的依據。
試劑/管號 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
BSA/ml(250ug/ml | 0 | 0.1 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
蒸餾水/ml | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
試劑甲/ml | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
試劑乙/ml | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
樣品測定:
(1)取 1 毫升樣品溶液(約含 20-250微克多肽或蛋白質)加入 5 毫升試劑甲混勻,
于溫室放置 10 分鐘。
(2)加入0.5毫升試劑乙(Folin——酚),立即搖勻,于室溫保溫 30 分鐘:然后
500nm處比色,以 1 毫升水代替樣品作空白對照。測定后,可以從標準曲線中查出
未知樣品濃度。若用 0.5 厘米光程的比色杯進行比色,可按下面方法進行操作:取
0.2 毫升樣品溶液(約含 5-100微克多肽或蛋白質),加入 1 毫升試劑甲(可選用
0.3-0.5 厘米直徑的小試管)混勻,10分鐘以后,再加入 0.1 毫升試劑乙,立刻混
勻,30 分鐘后比色一般來說,若多肽或蛋白質濃度在 2-25 微克,則采用波長
755nm,而 25 微克以上則采用 500nm 比色為宜。