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免疫組化中抗體選擇要求
1、一抗選擇要點
(1)選擇單克隆還是多克隆抗體。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體,單克隆抗體能目標明確地與單一特異抗原決定簇結合,另一方面,即使是同一個抗原決定簇,在機體內也可以由好幾種克隆產生抗體,形成好幾種單克隆抗體混雜物,稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應中,一般單克隆抗體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對較低;而多克隆抗體特異性稍弱,抗體的親和力強,靈敏度高,但易出現非特異性染色(可以通過封閉等有所避免)。
(2)種屬來源。一般家兔來源的抗體多是多克?。欢∈髞碓吹目贵w多是單克隆,但也有另外。這條主要要與后面的二抗來源相匹配。
(3)實驗目的是檢測什么種屬的抗原,即species reactivity。這一點很重要,一般說明書上都有注明,如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。
(4)能否做免疫組化。一般一抗說明書都會注明做WB、IHC、ICC、IF等,建議選擇注明的抗體,因為一般都是經過文章證明。
(5)檢測標本類型。用于檢測石蠟切片還是冰凍切片,一般能做石蠟切片的抗體,可能都可以用來檢測冰凍切片,但能做冰凍切片的抗體,不一定能檢測石蠟切片中的抗原。
(6)生產廠家。我的經驗是國外抗體生產商原裝抗體質量一般沒問題,但有點貴;而國內分裝廠家用的一抗工作液,價格便宜,但有時結果的穩定性和重復性稍差,尤其不同批次重復性較差。
(7)價格與質量的矛盾。我個人認為一抗原裝質量可能會好點,因為許多一抗避免反復凍融,且在稀釋液中穩定性較差(若時間長),但價格較貴。
2、二抗選擇要點
(1)種屬來源。主要根據一抗種屬來源來決定購買二抗來源,如一抗是小鼠來源,那二抗就買抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。
(2)標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標記的二抗,以與后面的SP結合反應;而免疫熒光染色就需要購買不同熒光素標記的二抗,如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。這主要與后面有無三抗和三抗種類有關。
(3)選擇IgM還是IgG。一般一抗是IgM,那么二抗就選擇IgM;反之,一抗是IgG,則二抗選擇IgG。